高效液相色谱法在黄连解毒药剂质量检测上的应用

 

黄连解毒汤中的黄芩具有抗菌消炎、降压利尿、解热、镇静、利胆解痉等作用，是此方的主要药物，而黄芩苷是黄芩中的主要有效成分，因此测定其含量已成为黄连解毒药质量控制标准之一。目前医药界检测黄芩苷含量大多采用高效液相色谱法。本文就高效液相色谱法在黄芩苷含量测定上的应用情况及其存在的问题作一简述。

一、黄芩苷含量常用测定方法简介

1、薄层层析——比色法

将含黄芩苷的药剂经过薄层层析分离，紫外光下定位，用一定溶剂洗脱后，利用其结构上的酚羟基及其还原性进行显色。在721型分光光度计或72型光电分光光度计上测定其在黄芩苷吸收度，计算其含量。在该法中，薄层层析的回收率是含量测定精确与否的判断标准。该法与紫外法比较无明显差异。

2、薄层层析——紫外分光光度法

含黄芩苷的样品经薄层层析分离后，紫外光下定位，经洗脱在751G或752型分光光度计上测定其大最大吸收波长处的吸收度，计算其含量。须绘制黄芩苷的标准曲线，或求出回归方程。然后在标准曲线上查出相当于黄芩苷的含量，或用回归方程计算含量。在测定样品含量前，首先应对不同剂型的制剂进行一定的处理，再行测定。该测定法的缺点是制剂成分复杂、干扰组分多时，会影响测定结果，且薄层回收率受固定相、洗脱剂的影响，必须预先选择适宜的固定相和洗脱剂，才能得到令人满意的回收率。

3、双波长分光光度法

含黄芩苷的复方制剂可不经分离，直接在751G或Uv一265紫外分光光度计及UV-3000型双波长双光束自记式分光光度计上测定λ1(参比波长)和λ2(测定波长)处的吸收度，得吸收度差值ΔA，由此计算黄芩苷的含量。λ2为测定波长，是测定样品中黄芩苷的最大吸收波长，λ1为参比波长，是测定样品中干扰成分与黄芩苷等吸收处的波长。干扰成分在此波长处不影响黄芩苷的吸收度，不同成分的样品参比波长不同，须实际测定来确定。在λ1和λ2处黄芩苷的吸收度差只与样品中黄芩苷的浓度成一定的函数关系，且在一定浓度范围内两者为线性关系。这样，可通过测定△A，由标准曲线查出或由回归方程计算出黄芩苷的含量。双波长法是分光光度法中消除共存物干扰吸收的较理想方法，解决了普通分光光度法无法解决的问题，同时可用单波长分光光度计进行双波长测定，回收率满意，结果准确。

4、薄层扫描法(TLCS)

将含黄芩苷制剂在薄层板上层析分离，在选定λs和λR范围内直接用CS-910，CS-930薄层扫描仪扫描，得薄层斑点面积积分值，由回归方程计算出含量。该法分离能力强，点样量少，斑点集中，灵敏度高，不受其它成分干扰，方法简便，准确，多用于复方制剂的测定。但由于薄层板的展开、扫描都较费时，仍需进一步简化操作。

5、二阶导数光谱法

用岛津UV-365自动记录紫外分光光度计测定黄芩苷标准品及阴性对照液的二阶导数光谱，从中找出黄芩苷的最大吸收峰，而且干扰成分的二阶导数又为零时的吸收波长，在此波长处，测定标准溶液的二阶导数与浓度的回归方程。由此测定待测样品中黄芩苷的含量。该法能有效地消除其它组分的干扰，不需预先分离，方法简便、快速、准确，与分光光度法比较，结果接近。

6、高效液相色谱法(HPLC)

用高效液相色谱仪，在选定色谱柱上，用适宜的流动相使含黄芩苷制剂中黄芩苷内标物和其它成分达到良好的分离，经紫外检测可得峰面积，再用内标法或外标法由回归方程计算含量。高效液相色谱法方法简便、快速、重现性好，是质量控制的可靠手段。目前大多采用该法作为黄芩苷含量的检测方法。于生兰等(2003)首先在兽医药研究上应用HPLC法测定黄芩苷-β-环糊精包合物的含量，黄一帆等(2004)在超微粉碎对黄连解毒汤中黄芩苷溶出的影响研究中也应用HPLC法测定黄芩苷的溶出量。

二、高效液相色谱法存在的问题

1、供试品溶液制备方法繁锁

该法可直接测定溶液中黄芩苷含量，但测定黄芩其它剂型时，须先提取其中的黄芩苷成分，制成溶液才能准确测定。

2、黄芩酶对含量测定的影响

有资料表明湿润下的黄芩粉在32℃恒温5h，则黄芩苷完全酶解。王玺等发现，由于黄芩酶的存在，测定前若未先除酶，在测定操作中苷类会发生水解，形成很不稳定的邻三羟基黄酮，极易氧化变成绿色产物，影响黄芩苷含量的测定。因此他们建议在测定前应先采用快速加热烘干除酶法、蒸气除酶法将黄芩酶彻底破坏，或不必除酶而直接用乙醇提取也可以防止苷类水解。

3、溶剂及提取时间对含量测定的影响

新药双黄连含片是中药提取物组成的复方药物，在该药品标准(试行)中测定黄芩苷含量采用高效液相色谱法，其中供试品溶液制备采用50％甲醇-水超声提取10min，但实际应用中，却发现该法测定结果经常出现偏低现象。因此，刘乃强等按数理统计的正交试验法，对提取过程采用不同浓度的甲醇、不同超声提取时间及不同的溶剂体积进行了考察，结果发现甲醇的浓度对测定结果有极显著的影响，含量测定结果随甲醇浓度升高而升高，以100％甲醇为最高，而在测定双黄连干粉合剂(属同种药物不同剂型)时，提取黄芩苷的溶剂以50％甲醇为佳；并随超声提取时间延长而升高，以30min为最高；随溶剂体积增大而升高，但50ml以上的体积对结果影响趋缓。据此他们建议双黄连含片的最佳提取方案以100％甲醇100ml超声提取30min为宜，结果可得加样回收率99.96％、RSD为1.4％。洪盈盈等采用HPLC法测定复方鱼腥草片中黄芩苷含量时也发现，对同一批样品分别在超声提取10、20、25、30、35、40min后测定，只有在30min提取完全。

由上可知，即使是同种药物，由于剂型工艺及所用辅料不同，或提取处理方法不同，提取效果就会不同。因此，对含有黄芩苷的不同制剂进行HPLC法测定，法定标准须全面而系统地研究，方可确定。

4、色谱条件问题

目前HPLC法的色谱条件尚存在一定差异。在上文所述《中华人民共和国药典》2000年版一部，15个涉及黄芩苷含量测定的HPLC法中，其检测波长共有274、275、276、278、280、283、315nm七个，流动相系统共有甲醇-水-磷酸、甲醇-水-冰醋酸、甲醇-0.2mol／1磷酸二氢钠、甲醇-四氢呋喃-0.055％磷酸四个，而在文献报道中尚有其他一些检测波长和流动相系统。如洪盈盈等在检测复方鱼腥草片时采用甲醇-0.4％磷酸为流动相，检测波长为277nm褚克丹等则认为乙腈-甲醇-0.2％磷酸作为复方黄芩液测定的流动相较1995年版药典所采用的甲醇-水-磷酸为好；孙冬梅等在健胃舒颗粒质量标准的研究中则采用甲醇-水为流动相，检测波长230nm进行测定黄芩苷含量。

由此可见，虽然高效液相色谱法具有诸多优点，但由于供试品溶液的制备方法及色谱条件会不同程度地影响测定结果，因此实验时应采取什么样的条件，尚需进行大量地研究。