用UPLC研究药物代谢动力学

药物代谢动力学涉及药物在肌体内吸收、分布、代谢和排泄过程的研究，包括药物及其在各种复杂基质(全血、血浆、尿、胆汁及生物组织)中代谢物的分离、结构鉴定以及痕量分析测定。肌体的体液系统中存在大量的保留时间相同、相对分子质量也相同的干扰组分;而目前药物研制日趋低剂量，使常规的分离检测技术难以满足复杂介质中痕量成分准确定量的要求。能否在复杂的体液系统中快速检测和鉴定出药物的代谢产物，依赖于高效的色谱分离和灵敏的高分辨质谱技术的联用。采用超高效液相色谱-MS联用技术进行药物代谢及药物动力学研究，体现了其高灵敏度和高专属性特点，而且能够同时测定样品中复方制剂的多组分浓度，实现样品高通量分析。

1、化学药品代谢产物的分析

DasandiB等建立了超高效液相色谱-MS/MS定量测定人血浆中喹那普利和喹那普利特的方法，采用AcquityBEHC18色谱柱(100mm@2.1mm，1.7Lm)，以赖诺普利为内标，喹那普利和喹那普利特线性范围分别为5.010~500.374ng/ml和10.012~1000ng/m，l定量限分别为5.010ng/ml和10.012ng/ml。日内和日间精密度的RSD均小于10%，喹那普利、喹那普利特和赖诺普利的回收率分别为85.8%、62.6%和61.3%，样品的分析时间仅需3min。ZhangSQ等[13]利用超高效液相色谱-MS/MS对人血浆中紫杉醇的衍生物(NPD-103)进行了定性和定量，流动相为甲醇-0.1%甲酸(75B25)，NPD-103的回收率分别为95.58%(1.0mg/ml)、102.43%(5.0mg/ml)和97.77%(10.0mg/ml)，线性范围为0.1~20.0mg/ml(r=0.999)。MingDS等建立了超高效液相色谱-MS/MS测定人血清中氯氮平和去甲可待因浓度的方法，采用AcquityBEHC18色谱柱(50mm@2.1mm，1.7Lm)，甲醇-水(含0.2%氨水)为流动相，流速为0.40ml/min。YadavM等[15]利用超高效液相色谱-MS/MS同时测定人血浆中洛匹那韦和利托那韦的浓度，并对36位健康印度人的生物等效性进行了研究。利托那韦和洛匹那韦的线性范围分别为2.9~1452ng/ml和29.6~14379ng/m，l平均回收率分别为97.5%和96.6%。BhaveshD等[16]利用超高效液相色谱-MS测定人血浆中非诺贝酸含量，以甲芬那酸为内标，线性范围为0.05~7.129mg/m，l定量限为0.05mg/m，l日内和日间精密度均小于9.3%，非诺贝酸和甲芬那酸的提取回收率分别为66.7%和52.6%，样品分析时间仅为1.8min。BergT等建立超高效液相色谱-MS/MS测定尿中阿片类和可卡因含量，采用阳离子交换固相色谱柱对样品进行提取，以5mmol/L碳酸氢铵溶液(pH10.2)-甲醇为流动相，对吗啡、可待因、6-乙酰基吗啡、吗啉吗啡、羟氢可待酮、乙基吗啡、可待因和苯甲酰爱康宁等成分进行了梯度洗脱。Licea-PerezH等利用超高效液相色谱-MS/MS同时测定人血清中的睾酮和5A-二氢睾酮，取血清300Ll经甲基叔丁醚液液提取后，加入2，3-吡啶二羧酸衍生化提高检测灵敏度，供试品溶液经固相萃取柱净化后进样，睾酮和5A-二氢睾酮的检测浓度分别为0.2~40ng/ml和0.01~2ng/ml。方法灵敏度高，专属性强，适用于睾酮的药动学研究。CaiS等[19]利用超高效液相色谱-MS/MS测定人血浆中米格列奈含量，以那格列奈为内标，血浆经乙醚提取后进样，经AcquityBEHC18色谱柱(50mm@2.1mm，1.7Lm)色谱柱分离，流动相为甲醇-10mmol/L醋酸铵(65B35)，流速为0.25ml/min。线性范围为1.080~5400ng/m，l最低检出量为1.080ng/ml。

HuXL等建立了超高效液相色谱-MS/MS定量测定健康人血浆中阿托伐他汀浓度及药物代谢动力学研究，血浆样品经磷酸酸化后，采用叔丁基甲醚提取，内标法(以格列齐特为内标)定量，并用于24名健康男性志愿者单剂量口服10mg阿托伐他汀钙片的药动学研究。该方法快速、灵敏、可靠，适用于阿托伐他汀钙临床用药监控和药代动力学的研究。HermesLi2cea-P等利用超高效液相色谱-MS/MS结合带液液萃取及衍生化的半自动样品处理技术，同时检测人血浆中口服避孕药中乙炔基雌二醇(EE)与左炔诺孕酮(LN)，其浓度范围分别为0.01~2ng/ml与0.1~20ng/ml。该方法将6min的检测时间缩短到2.7min，所需的血液用量也从500Ll减至300L，l能成功用于药物代谢动力学研究。YunshengH等比较了各种快速液相色谱与质谱串联技术，同时检测大鼠血浆中低剂量(ng/ml)克拉屈滨和克罗拉滨含量的方法。得出结论为超高效液相色谱-MS/MS较HPLC-MS/MS方法，具有更高的灵敏度、更好的分离度、更快的速度、更高的经济价值及可靠性，同时也能避免母离子抑制效益。

2、生化药品代谢产物的分析

Wang等利用超高效液相色谱-MS同时定量检测老鼠肝微粒体中7种单羟基睾酮代谢产物(16A-，2A-，7A-，6A-，2A-，6A-，16A-羟基睾酮)，该方法可用于检测生物基质中睾酮66天津药学TianjinPharmacy2009年第21卷第6期羟化酶的活性。HirokiKawanishi等利用超高效液相色谱-MS分析C3H/HeNCrj小鼠毛发中组胺(HA)及其代谢产物，探讨毛发周期与寿命的影响因素。该方法分析小鼠中组胺与其代谢产物如1-甲基组胺(MHA)等。手性荧光化试剂DBD-F标记HA，DBD-PZ标记代谢产物，利用该方法将衍生物分离分析。该方法具有良好的线性范围，组胺与其代谢产物的检测限分别为0.21、1.0、0.17和0.11pmo，l小鼠毛干与毛根的组胺及代谢物浓度均被检出。该方法也能运用于毛发中其他各种化合物的分析研究。GanfengW等运用超高效液相色谱-MS/MS测定猴血浆中的SCH503034非对映异构体。在APCI选择性反应检测正离子模式下，检测SCH503034非对映异构体。线性范围均在1~2500ng/m，l批间平均偏差与相对标准偏差(RSD)分别为1.2%~3.6%与2.8%~10%。批内平均偏差与相对标准偏差(RSD)分别为1.3%~5.5%与2.3%~7.8%。异构体回收率在2.5、50和1000ng/ml水平时，分别为87.2%~90.0%、89.1%~90.4%和92.3%~94.3%。定量限为1ng/ml。该方法具有更高的分析通量、灵敏度及分离度，不仅能用于猴血浆检测，还能检测小鼠、狗及人血浆样本。

3、中药代谢产物的分析

随着天然药化、中药药理、中药分析等相关学科的发展，中药药物代谢动力学科逐渐成为现代中药学科研究的重要内容之一。由于中药组分复杂，有效成分多样化且含量低，超高效液相色谱具有高分离度，高灵敏度等优点，近年来越来越多的研究者采用超高效液相色谱-MS/MS技术研究中药化学成分的体内代谢转化。WangX等[26]使用超高效液相色谱-MS在多反应监测(MRM)模式下，建立了测定大鼠血浆中的双氢槲皮素。血浆样品在乙酸乙酯液液提取后，经Sunfire色谱柱(2.1mm@50mm，3.5Lm)分离测定，线性范围为6~6750ng/m，l日内和日间精密度均小于8%，回收率为92.9%~105.1%，最低检出限为6ng/m，l大鼠双氢槲皮素的绝对生物利用度为0.17%。XiXY等利用超高效液相色谱-MS/MS在正离子模式及多反应检测模式下，检测大鼠血浆中牡荆葡基黄酮-2.-O-鼠李糖苷(VOR)。线性校正曲线范围在10~2500ng/m，l定量限为10ng/ml。VOR平均萃取回收率为(97.2?2.6)%。该方法首次成功运用于口服单剂量(120mg/kg)的VOR药代动力学研究。对中药复方制剂的代谢研究中，Wang等利用超高效液相色谱-MS建立了中药复方茵陈蒿汤45个化合物的指纹图谱，以及该复方经口服进入小鼠体内后所产生的21个代谢产物的指纹图谱。进行比对发现，其中19个代谢产物是原形化合物，而6-甲氧基香豆素-7-羟基硫酸盐(6-methoxycoumarin-7-hydroxylsulfate)和7-甲氧基香豆素-6-羟基硫酸盐(7-methoxycoumarin-6-hydroxylsulfate)是6，7-二甲基香豆素(6，7-dimethylescu1etin)的两个代谢产物。超高效液相色谱-MS的高灵敏度、高分离度及高峰容量，可以为中药复方制剂的药代动力学及作用机理研究提供更多有用的化学信息。